抗凝剂②

　　抗凝剂

　　医疗用途：治疗静脉炎，阻止血块在静脉里形成。

　　体育用途：避免促红细胞生成素使血液变稠。

　　应用物理或化学方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，称为抗凝。能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。

　　如天然抗凝剂（肝素，水蛭素等）

　　Ca 2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）

　　原理：使凝血酶原不能激活，Ca 2是凝血因子IV，其他的是蛋白类》.

　　离心技术是根据颗粒在匀迷圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。

　　1．用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。

　　2．用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化样品的有关性能进行研究。

　　一、基本原理

　　1．离心力Centrifugal force (F)

　　F=m2r

　　：旋转角速度(弧度／秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm)

　　m：颗粒质量

　　2．相对离心力 Relative centrifugal force (RCF)

　　RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数

　　RCF=F离心力／F重力

　　= m2r/mg= 2r/g

　　g为重力加速度(980．70g/sec2)

　　同为转于旋转一周等于2弧度，因此转子的角速度以每分钟旋转的次数(每分钟转数n或r/min)表示：

　　一般情况下，低速离心时常以r／min来表示，高速离心时则以g(或数字Xg)表示。

　　用X g表示每分钟转速可以真实反映颗粒在离心管不同位置的离心力。DoleCotzias制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图(图215)。

　　3．沉降系数 Sedimentation coefficient (S)

　　当转子内样品绕着旋转轴离心时，样品沉降率是由样品颗粒的大小、形状、密度和溶剂的粘度、密度以及离心加速度决定的，在一般情况下，样品的沉降特征可以用沉降系数来表示：

　　S：是指单位离心场中粒子移动的速度。

　　S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。

　　S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒，1S二110-13秒。对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系数S也常保持不变。文献中常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。

　　二、离心设备

　　离心技术所使用的设备是由离心转子、离心管及附件等组成。

　　(一)离心机

　　1. 低速离心机

　　一般最高转速在6000r/min以下。实验室中常用于分离制备。

　　2．高速离心机 带有能够冷却的离心腔制冷设备，这类离心机的速度控制比上述的低速离心机来得准确，工作时的实际速度和温度可通过仪表显示；配有一定类型及规格的转子，可根据需要选用。此类离心机的最高转速在25000r／min以下，常用于生物大分子的分离制备。

　　3．超速离心机 由四个部分组成，即驱动和速度控制；温度控制；真空系统以及转于。至今超迷离心机最高转速为85000-／min(可达600，000g左右)。常用于分离亚细胞器、病毒粒于、DNA、RNA和蛋白质分于，在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质，故为观察它们的天然结构与功能提供了手段。

　　(二)转子

　　主要有三种：

　　固定角式转子(fixedangle rotor)；水平转子(swingout rotor)；垂直转子(vertical rotor)，还有带状转子(zonal rotor)和连续转于(continuous rotor)等。

　　1．固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度，角度变化在1440之间，常见的角度有20、28、34及40等。

　　因角式转子的重心低，转速可较高，样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径；又因为有一定的角度，故在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀，这就是管壁效应，此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。

　　2．水平转于 此类转于静止时，处在转子中的离心管中心线与旋转轴平行，而在转子旋转加速时，离心管中心线由平行位置逐渐过渡到垂直位置，即与旋转轴成90角，粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本一致，但也有少量的管壁效应。

　　由于此类转予的重心位置较高，样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径。它对于多种成分样品分离特别有效，常用于速率区带离心和等密度离心。

　　3．垂直转子 离心管垂直插入转于孔内，在离心过程中始终与旋转轴子行，而离心时液层发生90角的变化，从开始的水平方向改成垂直方向，转子降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。这是因为在进行密度梯度离心前，由于重力的作用，垂直转予的粒子沉淀距离等于离心管的直径，离心分离所徭的离心力最小，适用于速率区带离心和等密度离心，但一般不用于差速离心。

　　三、离心分离方法

　　根据离心原理，按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分三类

　　1. 平衡离心法 根据粒子大小、形状不同进行分离，包括差速离心法(differential velocity centrifugation)和速率区带离心法(rate zonal centrifugation)。

　　2．等密度离心法(isopynic centrifugation)又称等比重离心法，根据粒子密度差进行分离，等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。

　　3．经典式沉降平衡离心法 用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化。

　　(一)差速离心法

　　它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

　　差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

　　2．注意点：

　　①可用角式、水平式转头

　　②可用刹车

　　③难以获得高纯度

　　例：用差速离心法分离已破碎的细胞各组份

　　(二)速率区带离心法

　　1．原理

　　速率区带离心法是离心前在离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒于的最小密度。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。

　　梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

　　该离心法的离心时间要严格控制，即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任意一个粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。

　　2．注意点：

　　①严格控制离心时间

　　②粒子密度大于介质密度

　　③样品事先配制在较平缓的连续密度的梯度溶液

　　④不能用角式转头、只能用水平式转头

　　⑤不能用刹车

　　(三)等密度离心法

　　1．原理

　　等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时dr／dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

　　2．注意点：

　　①离心时间要长

　　②可用角式转头或水平式转头

　　③粒子密度相近或相等时不宜用

　　④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度

　　⑤不能用刹车

　　四、梯度溶液的制备

　　(一)梯度材料的选择原则：

　　1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。

　　2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。

　　3．不会对离心设备发生腐蚀作用。

　　4．容易纯化，价格便宜或容易回收。

　　5．浓度便于测定，如具有折光率。

　　6．对于分析超迷离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是己知的。

　　(二)梯度材料的应用范围 下面简单介绍几种常用的密度梯度材料的性质及其应用范围。

　　1．蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1．33g/ml，且由于价格低，容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。

　　2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

　　3．氯化铯：是一种离于性介质、水溶性大，最高密度可达1．91g／nd。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。

　　4．卤化盐类：KBr和NaCI可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

　　5．Percoll: 是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP)，渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的。其粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。

　　五、分析性超速离心

　　与制备性超速离心不同的是：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组分。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。

　　分析性超速离心的工作原理：

　　分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子，一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴联接一个高速的驱动装置，这轴可使转于在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳二个小室：分析室和配衡室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收(如对蛋白质和DNA)或折射率的不同对沉降物进行监视，后一方法的原理是：当光线通过一个具有不同密度区的透明液时，在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产生一峰。由于沉降不断进行，界面向前推进，故峰也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标.