早年
周作人出生在绍兴府城内的周家新台门（今绍兴鲁迅故居），籍贯属会稽县。出生时祖父周福清在京任官，得到家信时正好有一魁姓旗人来访，遂将这个孙子取名“櫆寿”，与长孙“樟寿”（鲁迅原名）对应。周作人幼年在家乡的私塾书屋（三味书屋）里接受传统的国学教育，1898～1899年和1900～1901年两次参加科举均止于院试。
后来在国内新学的风潮中，于1901年到南京进入江南水师学堂（民国后改海军军官学校），在管轮班（轮机科；轮机专业）读了6年，当时专业科目都用英文书，他因此有了相当的英文基础，后来考取官费生，和哥哥鲁迅、好友许寿裳（季茀）等人留学日本。
留学日本
他以学“造房子”（土木工程、建筑工程）的名目出国，抵日后先读法政大学预科，后入东京立教大学修希腊文和英文等西方语文（周作人的古英语颇有水平），研读《远征记》（苏格拉底的学生色诺芬的著作）等文学经典，课后也到神学院学福音书的希腊原文。课余和哥哥翻译出版了《域外小说集》（在1909年的2月，印出第1册，到6月间，又印出第2册），这两部译作以东欧弱小民族文学为主，也包括王尔德等的作品，其中的迦尔洵的《四日》，安特来夫的《谩》和《默》这3篇是鲁迅翻译，鲁迅校订了周作人翻译的其他各篇，这是史上第1部直接从英语、德语原文翻译成汉语古文的短篇小说集。
鲁迅、周作人1920年3月20日给这1年的重印版写的〈域外小说集序〉里说：每集在东京只卖去20本就再也没有人买了，第1集另有1本是许寿裳怕寄售处不遵定价，额外需索而去试买的（半年过去了，先在就近的东京寄售处结了帐。计第一册卖去了二十一本，第二册是二十本，以后可再也没有人买了。那第一册何以多卖一本呢？就因为有一位极熟的友人，怕寄售处不遵定价，额外需索，所以亲去试验一回，果然划一不二，就放了心，第二本不再试验了——但由此看来，足见那二十位读者，是有出必看，没有一人中止的，我们至今很感谢），上海的寄售处“是至今还没有详细知道。听说也不过卖出了二十册上下，以后再没有人买了。于是第三册只好停板，已成的书，便都堆在上海寄售处堆货的屋子里。过了四五年，这寄售处不幸被了火，我们的书和纸板，都连同化成灰烬；我们这过去的梦幻似的无用的劳力，在中国也就完全消灭了。”
胡适在《五十年来中国之文学》里说：“周作人同他的哥哥也曾用古文来译小说。他们的古文工夫既是很高的，又都能直接了解西文，故他们译的《域外小说集》比林译的小说确是高的多。”
蔡元培1919年3月18日写给林纾的公开信里说：“周君所译之《域外小说》，则文笔之古奥，非浅学者所能解。”
周氏兄弟、许寿裳、钱玄同等在日本时师从章太炎学《说文解字》，并相互结下友谊。另外周作人在日本还短暂学习俄文（与鲁迅等共学）、梵文（与老师章太炎共学，教师是会说英语的旅日印度人，周给老师做英语翻译）等。
民国成立后
1911年从日本回中国，1912年做了半年浙江省教育司视学（督学），后转浙江省立第五高级中学教员，教了4年英文，1917年到北京大学附属国史编纂处做编纂，半年后的1918年出任北京大学文科（文学院）教授，担任希腊罗马文学史、欧洲文学史、近代散文、佛教文学等课程，并创办北京大学东方语言文学系，出任首任系主任，该系师资还有张凤举、徐祖正等，后来因中日战争爆发而停办。他清新淡雅，如话家常的白话文，洋溢着深厚的中国、东洋、西洋古典与近现代文化素养，轰动一时，新文化运动中更发表影响深远的《人的文学》、《平民文学》、《思想革命》等启蒙主义理论文章。
周作人还广泛参与社会活动，1919年起任中华民国教育部国语统一筹备会会员，与马裕藻、朱希祖、钱玄同、刘复、胡适5位北大教员兼国语会会员在会上联名提出《请颁行新式标点符号议案》，经大会通过后颁行全国。1922年与钱玄同、陆基、黎锦熙、杨树达、胡适、沈兼士等会员任国语统一筹备会汉字省体委员会委员（共16人）。
1922年，在“非基督教运动”高潮中，他和钱玄同、沈士远、沈兼士及马裕藻发表《信仰自由宣言》，重申信仰自由的精神。
1925年在女师大风潮中，周作人支持进步学生，与鲁迅、马裕藻、沈尹默、沈兼士、钱玄同等人连署发表《对于北京女子师范大学风潮宣言》，并担任女师大校务维持会会员。
1927年，李大钊等20余名国民党员（有的身兼共产党员身份）被奉系军阀张作霖绞死。周作人在冒有生命危险的情况下，把李氏子女李葆华和李星华藏在自己北京西城八道湾胡同的家中。此后，对李氏遗孤的救济帮助一直持续近20年。
抗日战争期间
留平教授1937年卢沟桥事变后，北京大学撤离北平，他没有同行，成为四名“留平教授”之一（另外3位留守的教授是孟森、马裕藻、冯祖荀），受校长的委托看守校产。北大校长蒋梦麟后来在回忆录（《西潮》和《新潮》）里谈到：“抗战的时候，他留在北平，我曾示意他说，你不要走，你跟日本人关系比较深，不走，可以保存这个学校的一些图书和设备。于是，他果然没有走，后来因他在抗战时期曾和日本人在文化上合作，被捉起来关在南京。我常派人去看他，并常送给他一些需用的东西和钱。记得有一次，他托朋友带了封信出来，说法庭要我的证据。他对法庭说，他留在北平并不是想做汉奸，是校长托他在那里照顾学校的。法庭问我有没有这件事？我曾回信证明确有其事。结果如何，因后来我离开南京时很仓促，没有想到他，所以我也没有去打听。”
神秘枪击案
1939年元旦，自称是他的学生并自称姓李的客人求见周作人，突然开枪将他击倒，子弹射中铜扣而受轻伤。凶手逃逸后未被捉获。有关枪击案的凶手是谁一直众说纷纭。周作人始终坚持是日本军方的阴谋，日方则说是国民党特务所为。战后有人在美国撰文，自称当年是学生，不满周的亲日行止而下手。以时间点来说，周作人当时并没有出任傀儡政权的任何行政职务，他先是应胡适主持的文化基金编译委员会委托，在家里翻译英文和古希腊文稿件，直到文化基金编译委员会搬到香港。1938年9月起至燕京大学（美国基督教背景）国文系每周授课6小时，担任客座教授。但遭行刺后日本宪兵进驻周作人家，确加速民众对其亲日印象的怀疑。
出任汪精卫政权职务
经过枪击案的身心冲击，周作人在1939年1月接下汪精卫南京政府国立北京大学图书馆馆长的聘书，3月应聘兼任北京大学“文学院筹办员”，开学后兼任文学院院长。
1940年11月8日，汪精卫政权华北政务委员会教育总署督办汤尔和因肺癌病逝，1940年12月19日，汪精卫政权中央政治委员会31次会议通过“特派周作人为华北政务委员会委员，并指定为常务委员兼教育总署督办”，1941年元旦正式上任。
1941年10月起兼任东亚文化协议会会长，1943年6月起兼任华北综合调查研究所副理事长，1944年5月起兼任《华北新报》经理和报道协会理事、中日文化协会理事。
战后
抗战结束后，1945年12月在北京以汉奸罪名被蒋介石主政的国民政府逮捕，并押解南京受审，监禁于老虎桥监狱，周的朋友、学生纷纷为他开脱求情，俞平伯还给在美国办外交的胡适写了封长信，请求胡适为周说情。1946年11月6日，高等法院判处他14年有期徒刑，1947年12月9日改判10年有期徒刑。
洪炎秋《我所认识的周作人》（1967年7月发表）一文写到“理学院仍设景山东街前北京大学理学院原址，文学院因为沙滩红楼被日本宪兵队所占据，乃在马神庙北大图书馆边新盖三层大楼一座供用；这两个学院在沦陷期间，不但丝毫没有受到破坏，而且多少增加了一些设备，所以周作人胜利后在法案受审时，供称他留在北平，并不是想当汉奸，是蒋梦麟校长托他在那里照顾学校的，这桩事有蒋前任校长去函法院证实，而新任校长胡适之也替他证明有保全北大的图书和设备之功，所以法院宽大为怀，只判了他十年的有期徒刑。”
郑振铎说：“日本妻子（羽太信子）给了他不好的影响”。
1949年1月22日，李宗仁接任中华民国总统，在国共和谈的空气中，下令释放政治犯，周作人在1949年1月26日被放出监狱，坐火车到学生尤炳圻在上海的家暂住。
他曾通过尤炳圻联系以前教过的台湾籍学生洪炎秋（1946年回台湾，1948年起在台湾大学教书）表示有意到台湾，在北京大学修过周先生2学期2学分近代散文的洪炎秋〈我所认识的周作人〉1文回忆：“周作人知道将被释放，叫尤君写信给我，说他想来台湾，问我有没有法子安置。我就找了老友郭火炎医师，向他借用北投的别墅供住，郭君满口答应，我于是立刻回信给尤君，告诉他住所已有，日常生活费用，我和老友张我军可以负责设法，可是他出狱后没能即刻来台，后来就断绝消息了。”
他不到台湾与傅斯年在1949年1月20日接任台湾大学校长不无关系。
胡适从上海要到美国前，曾托王古鲁游说他离开中国，他反托王古鲁劝胡适不要离开中国（见《知堂回想录》）。
1949年8月14日，他从上海回到中国人民解放军管治下的北平定居。
郭宇一《毛泽东与周作人》文中指出毛泽东很早就与周作人来往的事实，文中引1920年4月7日《周作人日记》：‘毛泽东君来访’。“君”常用于老师称呼学生。(毛在北京大学图书馆工作时旁听了许多课程，并造访了多位老师，《胡适日记》1920年1月15日有记载‘毛泽东来谈湖南事’。)《毛泽东与周作人》文中说周作人1949年后“给周恩来写了一封六千多字的长信，作了一些检讨，也为自己的过去作了一些解释。周恩来将这封信转呈毛泽东”。今非昔比的毛泽东，对昔日老师的信以如下口气作了批示：“文化汉奸嘛，又没有杀人放火。现在懂希腊文的人不多了，养起来，做翻译工作，以后出版”。与他对另一位昔日老师胡适的口气如出一辙(“只要胡适不走，可以让他做北京图书馆馆长”)。但据郭宇一的文章，“毛是否真的看到周作人的这封信，真的是否作了这样的批示，学界目前尚有争论”。
周作人的学生在台湾的有许世瑛（许寿裳大儿）、张我军（板桥人）、郑骞、洪炎秋（彰化人）等，作家张深切在北京曾和周作人来往。
中华人民共和国成立后
周作人在1951年给毛泽东写信，胡乔木1951年2月24日给毛泽东书面报告说：“周作人写了一封长信给你，辩白自己，要求不要没收他的房屋，不当他是汉奸。”“我的意见是：他应当彻底认错，像李季一样在报纸上悔过。他的房屋可另行解决（事实上北京地方法院也并未准备把他赶走）。他现已在翻译欧洲古典文学，领取稿费为生，以后仍可在这方面做些工作。周扬亦同此意。当否请示。”毛泽东批了：“照办。”翻译
周作人从1952年8月起出任北京人民文学出版社编制外特约译者，每月预支稿费200元人民币，按月交稿。
反右运动中，在北京图书馆工作的儿子周丰一被划为右派，停发工资，让他的经济负担大增，只好给中央领导同志写信。
在康生和周扬的过问下，稿费从1960年1月起，调高到每月400元人民币。
1964年9月起社会主义教育运动进入高潮，其稿费又减半至每月200元人民币，当时他的爱人羽太信子已去世。
这段期间，他翻译日本古典文学和古希腊文学作品多部，同时应邀校订别人的译稿（《今昔物语集》、《源氏物语》等），日本现代文学译作有：《石川啄木诗歌集》等。
有些没有结集的日本文学中短篇译作散见中国和香港传媒。
他每个月开销颇大，在写给香港曹聚仁的信件里面曾说：“人民文学社派人来说，每月需用若干。事实上同顾颉刚一样，需要五百一月，但是不好要得太多，所以只说四百。以后就照数付给”。“因为负担太重太多，所以支出太巨，每月要不足百元以上，这是我拮据之实情。”
写作
回忆鲁迅的专书著作有：《鲁迅的故家》、《鲁迅小说里的人物》、《鲁迅的青年时代》。
在报刊发表散文随笔，后辑成《木片集》。
经曹聚仁介绍，在香港传媒连载回忆录《知堂回想录》，后结集出版。
文革期间
1966年5月，文革开始。6月起，人民文学出版社不再给周作人预付稿费。8月2日，他被红卫兵查封了家，并遭到皮带、棍子抽打。其后周作人两次写了短文让儿媳张菼芳交给当地派出所，以求服用安眠药安乐死，都无音信。1967年5月6日，周作人下地解手时突然发病去世，享寿82岁。