抗日战争爆发后，留在江西、福建、广东、湖南、湖北、河南、浙江、安徽八省十几个地区的红军游击队，遵照中共中央的指示，和国民党进行谈判，停止内战，改编为国民革命军新四军，开赴前线抗日。陈毅当时既对国民党反动派保持高度的警惕，随时击破敌人企图利用谈判消灭游击队的阴谋，同时深入各游击队根据地，传达中央的指示，对红军干部、战土做了许多细致的思想工作，说服大家适应形势的转变。1938年1月，新四军军部在武汉宣告成立，陈毅就任中共中央军委新四军分会副书记、第1支队司令员，不久，率新四军第1支队和第2支队挺进苏南，开辟了以茅山为中心的抗日游击根据地，任江南指挥部指挥，率部在南京、上海之间打击日伪军。继而，陈毅派部队以'江南抗日义勇军'的名义继续东进，直迫上海近郊。虹桥机场一战，烧毁敌机四架，震惊中外。
1939年冬和1940年春，国民党顽固派发动第一次反共高潮遭到惨败之后，加紧在华中制造摩擦事件。陈毅又派叶飞、陶勇等先后率部渡江北进，开辟苏北根据地，对国民党顽固派进行针锋相对的斗争。盘踞苏北的国民党江苏省政府主席、第24集团军司令韩德勤依仗他的优势兵力，妄想一口吃掉苏北的新四军。苏北地区李明扬、李长江的地方杂牌军和宋子文系统的陈泰运税警部队，同国民党的嫡系韩德勤部队有一定的矛盾。陈毅坚决执行'发展进步势力、争取中间势力、反对顽固势力'的策略，对李明扬、李长江以及陈泰运等部采取又团结又斗争的方针，做了大量工作，使他们在国民党顽固派向新四军侵犯时，保持中立。同年10月，韩德勤率领一个军又一个旅1万5千人的兵力，进攻苏北新四军部队。陈毅、粟裕利用'诱敌深入，聚而歼之'的战术方针，把主力7千余人全部集中，并运用'求心退却'战术一直退到新四军苏北指挥部所在地黄桥镇，进行了有名的黄桥决战。战前，陈毅对部队进行动员，指出这一仗关系到能不能战胜国民党顽固派，在苏北打开局面，建立苏北根据地，要求部队全力以赴，进行决战。陈毅统一指挥这次决战，经过一天一夜激战，全歼韩德勤主力部队1万余人。蒋军第89军军长李守维仓促逃跑，淹死在河里。我军乘胜连下海安、东台，和南下的八路军会师白驹镇，打开了华中抗日的新局面。黄桥战役是陈毅、粟裕高超军事指挥艺术的具体体现，是执行统一战线政策，灵活运用战略、战术的结果，也反应了陈毅有魄力、有决心，果断地将政治仗和军事仗结合起来的杰出的领导才能。
皖南事变后，中共中央任命陈毅为新四军代理军长，刘少奇同志为政治委员，在苏北盐城重建新四军军部。由于陈毅和新四军其他领导运用正确路线、方针、政策，依靠群众，艰苦奋斗，新四军迅速发展，建立了七个师的部队，广泛开展抗日游击战争，建立抗日民主政权，抗击了华中地区大部分日伪军的'清乡'、'扫荡'，粉碎了国民党顽固派的摩擦进攻。以后，陈毅同阴谋家、野心家饶漱石展开了原则斗争。在陈毅正确领导下，新四军由抗战初期组建时的1万多人的兵力，到抗日战争结束时发展到30万人，和八路军一样，成为我党领导下的中国人民抗日的英雄部队。
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